三、操作技術的影響

操作過程的控制：

1. 嚴格按照試劑說明書進行操作。操作前將試劑在室溫下平衡30～60min。

2. 加樣后及時放人孵箱。標本較多時，要分批操作。按說明步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附于反應孔周圍，難以清洗che底。

3. 封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發，產生周邊現象從而導致“花板"的出現。

4. 用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產生拖帶現象而導致“花板"的出現。

5. 合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。

6. 加酶試劑后用吸水紙在酶標板表面輕拭吸干。

7. 顯色劑盡量在臨用前配制，堅持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍色的TMB顯色劑不用。

8. 加樣時保持顯色劑不外流;A、B液應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡。

9. 應保證C清潔，整個操作過程中保證酶標板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板"降至zui低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準確、可靠的實驗結果。

   加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準確性，直接影響檢測結果。由于吸嘴構造特殊，導致清洗困難，加大了交叉污染的機會。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經常清洗，定期校準。加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

   溫浴影響，在建立 ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原 抗體 反應一般在37℃經1-2 小時，產物的生成可達ding峰。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。由于公司的 試劑 盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。

   另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。96孔酶標板結構特別;易產生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍與內部孔升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果差異;干浴與水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。

   洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

   洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種 試劑 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

   洗液需要稀釋，應按要求稀釋。配制洗液應用新鮮的和高質量的純化水，電導率小于1.5μs/cm，洗液如果結晶應待其融解后配制。手洗條件一致性較差，對結果影響較大，防止洗液在孔內形成氣泡。半自動與全自動冼板機使用不當也會影響結果，血清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結晶易使洗板機針小孔全阻塞或半阻塞狀態，造成未結合標記酶洗脫不che底，導致“花板"造成假陽性或假陰性;所以操作洗板機過程中要不時觀察洗板機針孔內洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水清冼幾遍。